图像处理指南

为什么在空间分析中要使用图像数据

每一种组织在临床上的特征表达（如 mRNA 和蛋白质）可能不均匀，仅基于空间的表达信息去准确识别组织/细胞的边界将会具有较大的挑战。细胞核染色（比如 ssDN 荧光染色）或者苏木精-伊红（ H&E 染色）染色的组织图像在显微镜下可以清晰的显示整个组织区域，使用染色的图像可以显著改善组织或者细胞的轮廓信息。在确定组织边界后，可以将图像数据与空间表达分析的数据对齐，并利用边界信息获取组织或者细胞区域的热图，以进行更深层次的分析。

图像类型和格式

如下为 StereoMap 和 SAW 支持的数据格式说明：

Stereo-seq 芯片表面具有周期性的轨迹线（水平和垂直两个方向），在空间表达的热图上会展示为狭窄的线条，因轨迹线区域是没有捕获探针的，可以辅助矩阵跟图像的对齐。请严格参考 Stereo-seq 技术的组织染色和成像标准操作指南（SOPs），为最大程度地减小其对下游 mRNA 捕获率的影响并提高显微镜图像中轨迹线的可见性。在空间表达的热图和显微镜图像上可以同时看到这些轨迹线，故可以用作图像对齐的位置标记。

以下是图像和热图上的轨迹线示例。

Stereo-seq 分析流程软件包（SAW）嵌入了自动化图像处理算法，用于识别组织和细胞的边界，并可以在Stereo-seq 芯片上检测到轨迹线，以便将图像与特征表达矩阵对齐。如果无法检测到轨迹线或组织/细胞边界不清晰，您可能需要手动处理。

图像处理用户路线图

推荐的图像处理用户路线图如下：

1. 检查显微镜图像的质量。为简化后续的图像分析，强烈推荐在实验过程中做图像 QC，其目的主要确认是否可以检测到轨迹线，图像是否被准确的拼接，组织是否可见，最终为图像是否可以由 SAW 自动处理提供参考。为提升图像处理过程的用户友好性，QC 步骤也嵌入到图像处理模块中。有关 QC 评估指标和标准的信息，请参考 图像质控 Image QC 获取更多详情。
2. 图像与表达矩阵热图的配准。将图像与表达矩阵的热图重叠，可以调整图像的方向、尺度和角度等保证跟表达矩阵一致。对于多个免疫荧光（IF）的图像，请检查每个图像的配准结果。
3. 圈选组织和细胞。使用绘图工具提取感兴趣的 ROI 区域或者上传第三方工具生成的组织/细胞的Mask。对于免疫荧光 IF 图像，可以通过调节阈值区间获得 ROI 区域，因信号较弱的区域很可能是背景。选择准确的组织/细胞区域，对于生成高质量的图像数据是至关重要的，可以降低图像背景噪声对于后续分析的影响。
4. 导出操作记录文件。手动后的记录可以经过 SAW 的realgn流程提取组织或者细胞区域对应的空间表达矩阵。

如下页面将按照 step by step 的方式，展示 Stereo-seq 支持的图像数据，请参考如下操作指南：

图像处理入口

从 StereoMap 启动页的 Image Processing 进入图像处理。

选择与您图像相匹配的类型，目前支持三种图像类型。