scRNA-seq_v3用户手册
scRNA-seq_v3用户手册
1. 第一章 应用范围
scRNA-seq_v3可以处理以下试剂盒的高通量测序数据分析：
DNBelab C系列高通量单细胞RNA文库制备试剂盒套装V3.0。
2. 第二章 产品介绍
2.1 分析流程图
scRNA-seq标准分析流程是基于DCS智能云平台开发的一款自动分析流程，其中包括数据过滤及质控、参考基因组比对和注释、有效细胞筛选、下游分析，以及报告输出等多个功能，图2-1是分析整体流程图：
2.1.1 数据过滤及质控
根据配置文件中填入的数据质控标准进行fastq数据质控，经过过滤去除低平均碱基质量reads，截取指定长度reads等步骤，留下高质量的序列用于后续分析。
2.1.2 参考基因组比对和注释
使用STAR软件将过滤后的cDNA fastq文件与参考基因组进行比对，并进行UMI矫正，给出注释结果。
2.1.3 有效细胞筛选
采用EmptyDrops方法对原始矩阵进行有效细胞的选取，并通过余弦相似度合并细胞，生成用于下游分析的标准矩阵文件。
2.1.4 下游分析
基于生成的矩阵进行细胞质控和双胞过滤，对矩阵进行降维、聚类，进行细胞类型注释。
2.1.5 报告输出
综合分析结果，整理汇总成HTML报告。
3. 第三章 使用说明书
scRNA-seq标准分析流程通过STOmics时空云平台系统进行样本输入及报告输出的全流程管理。下面具体介绍基于STOmics时空云平台系统使用scRNA-seq标准分析流程的操作指南。
3.1 指南概述
本章介绍如何使用scRNA-seq标准分析流程进行分析。在使用之前，请认真阅读并理解其中内容，保证能够正确使用scRNA-seq。
3.2 使用场景一：手动投递
操作共包括四个步骤：上传数据、构建参考基因组（可选）、样本信息录入、启动分析。完成样本信息录入后，运行任务，当客户在看到任务状态为completed时，代表任务已完成，即可查看报告部分（详见3.4部分）。
3.2.1 步骤一：上传数据
- 点击导航栏**【数据管理】，进入数据管理页面，进入目标文件夹，点击右上角【+添加文件】-【工具上传】**上传数据（图3-1）。
- 点击**【立即上传】浏览并选择所需文件（图3-2），上传完成后文件会在目标文件夹中显示（如首次上传，则需点击【安装并启动传输客户端】**安装所需工具）。
3.2.2 步骤二：构建参考基因组（可选）
- 点击导航栏**【流程分析】进入流程分析页面，在搜索框输入scRNA-seq-build-index**，点击**【运行】**（图3-3）。
- 选择运行界面输入，输入Entity ID，点击**【下一步】**（图3-4）。
- 录入参考基因组信息，完成后点击**【下一步】**（图3-5）。
注意
参考基因组信息录入变量说明：
refName：参考基因组的物种名称，会显示在分析报告中；
GTF：基因组注释GTF文件；
chrM：线粒体名称；
FASTA：基因组FASTA文件；
Outdir：输出文件路径；
Cpu：运行所需CPU；
Mem：运行所需内存大小。
- 点击**【运行】**启动分析（图3-6）。
- 任务完成后，Status显示为completed，复制Task ID（图3-7），点击导航栏**【任务管理】，输入Task ID进行搜索（图3-8），其中star_index**文件将作为参考基因组文件参与单细胞RNA标准流程分析（图3-9）。
3.2.3 步骤三：样本信息录入
- 点击导航栏**【流程分析】进入流程分析页面，在搜索框输入scRNA-seq_v3****，点击【运行】**（图3-10）。
- 选择运行界面输入，输入Entity ID，点击**【下一步】**（图3-11）。
- 录入样本信息，完成后点击**【下一步】**（图3-12）。
注意
样本信息录入变量说明：
sampleID：样本名称，默认与Entity ID一致；
cDNA：cDNA文库fastq格式的R1、R2端序列；
Oligo：oligo文库fastq格式的R1、R2端序列；
genomeDir：参考基因组文件，如在步骤二（3.2.2 构建参考基因组）自主构建，选择Task ID文件夹内的star_index；
Outdir：输出文件路径；
expectcells：期望的细胞数量，可根据经验自行选择细胞数目；
forcecells：强制选取beads数目，根据骤降图强制截取 beads 数目；如为0则不参与计算；
Cpu：运行所需CPU大小，所需CPU最低值为8，推荐值为16；
Mem：运行所需内存大小。
3.2.4 步骤四：启动分析
点击**【运行】**启动分析（图3-13）。
3.3 使用场景二：表格投递
操作共包括五个步骤：上传数据、构建参考基因组（可选）、下载样本模板、填写并导入样本模板、启动分析。完成样本模板导入后，可批量运行任务，当客户在看到任务状态为completed时，代表任务已完成，即可查看报告部分（详见3.4部分）。
3.3.1 步骤一：上传数据
与使用场景一（手动投递）步骤一一致（详见3.2.1步骤一：上传数据）。
3.3.2 步骤二：构建参考基因组（可选）
与使用场景一（手动投递）步骤二一致（详见3.2.2步骤二：构建参考基因组）。
3.2.3 步骤三：样本信息录入表格下载
- 点击导航栏**【数据管理】，选择【表格】-【下载模板】（如图3-14）, 点击【Data model template】**，选择scRNA-seq_v3.2.0模板下载。
- 打开后scRNA-seq_v3.2.0样本模板Excel如图3-15。
3.3.4 步骤四：样本信息导入
- 该使用场景条件下，样本导入表格需填写工作表（图3-15）。该场景表示对已测序完成的样本数据在导入表格后，直接进入分析。
注意
注意事项：
[1] 导入文件路径必须在云平台已存在。
[2] 模板中，所有内容均为必填项，任何字段不得为空。
[3] Excel中的SampleID需唯一，如SampleID一致则默认为同一个任务，合并多对cDNA的fq进行分析，适配cDNA补充测序的情况。
[4] Excel中不能合并单元格，单元格内容前后不能有空格或特殊字符。
[5] 分析样本录入（图3-16）：
sampleID：样本名称，默认与Entity ID一致；
cDNA：cDNA文库fastq格式的R1、R2端序列；
Oligo：oligo文库fastq格式的R1、R2端序列；
genomeDir：参考基因组文件，如在步骤二（3.3.2 构建参考基因组）自主构建，选择Task ID文件夹内的star_index文件；
Outdir：输出文件路径；
expectcells：期望的细胞数量，可根据经验自行选择细胞数目；
forcecells：强制选取beads数目，根据骤降图强制截取 beads 数目；如果是0保留全部细胞；
Cpu：运行所需CPU大小，所需CPU最低值为8，推荐值为16；
Mem：运行所需内存大小。
- 配置好样本模板的分析样本录入工作表后，回到**【数据管理】界面，点击【表格】-【+新增表格】**（图3-17）。
- 点击**【点击上传/拖拽到此区域】浏览并选择已填好样本信息的表格，点击【确定】**（图3-18），上传完成后文件会在目标文件夹中显示。
- 点击导航栏**【流程分析】进入流程分析页面，在搜索框输入scRNA-seq_v3****，点击【运行】**（图3-19）。
- 选择表格数据输入，点击Please select table处，选择在本小节3）中导入的表格，选中所需的行，点击**【下一步】**（图3-20）。
- 在Values处点击并选择对应的值，如cDNA选取${cDNA1}和${cDNA2}，注意按顺序选取（如图3-21）；Oligo选取${Oligo1}和${Oligo2}，注意按顺序选取（如图3-22）。
- 录入样本信息，完成后点击**【下一步】**，确保参数设置无误（如图3-23）。
3.3.5 步骤五：启动分析
点击**【运行】**启动分析（图3-24）。
3.4 报告查看及结果文件下载
- 点击导航栏**【任务管理】**，当任务状态显示为completed时，代表任务已完成，即可查看报告部分（如图3-25）。
- 点击导航栏**【数据管理】，进入数据管理页面，根据任务的Task ID进行搜索，点击进入Task ID**文件夹（如图3-26）。
- 点击进入Entity ID文件夹（如图3-27）。
- 点击进入04.report文件夹（如图3-28）。
- 选中Entity ID_report.html文件夹，点击**【传输】-【下载】-【镭速工具下载】**（如图3-29）。
- 点击**【传输】-【下载】-【确定】**，选择目标目录并下载报告（如图3-30）。
4. FAQ
- 官方的单细胞流程有哪些，分别对应试剂盒的版本是什么？
scRNA-seq_v3与scRNA-seq-3.1.5为官方维护流程。
scRNA-seq-3.1.5，对应试剂盒DNBelab C系列高通量单细胞RNA文库制备试剂盒套装V2.0。
scRNA-seq_v3对应智造的流程是dnbc4tools v2.1.2，对应试剂盒：DNBelab C系列高通量单细胞RNA文库制备试剂盒套装V3.0。
- 构建Reference后gtf文件格式要求是什么？
gtf文件中染色体名称与基因组文件中的染色体名称要一致。