StereoMap V4

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StereoMap V4

可视化指南

探索 Stereo-seq 数据的关键模块，您可以交互式地研究组织内不同 bin 或者 cell 下的特征表达分布情况。此外，它可以支持图像或多组学数据一同或并排展示，为下游分析提供更多参考信息。

可视化入口

以下几种方式均可打开可视化数据：

在任务管理模块中，找到SAW-ST-V8流程所产生的任务，点击“可视化”按钮，即可进入可视化界面。
在交互分析模块中，从StereoMap V4.0启动页的 Visual Explore 进入可视化。在数据管理页面，您可选择SAW-ST-V8流程的任务文件夹、或直接选择“任务文件夹-visualization文件夹”中的 .stereo 文件、或单独选择需要查看的可视化文件。

可视化输入文件

查看 SAW 输出的文件夹(visualization)，将会找到一个.stereo的清单文件，用户可以直接使用该清单文件打开可视化的数据，它包含了 SAW 输出的visualization 文件夹中用于可视化展示的文件路径映射信息。在使用.stereo的清单文件打开可视化的数据时，请您务必遵循如下规则：

默认情况下，可视化展示的所有文件与清单文件都在相同的目录路径中进行管理，强烈建议保持 SAW 输出的原始目录的文件结构。如果某个文件被移动到另一个位置或文件名已更改，请切记一定要修改清单文件中对应的文件路径。
可视化模块的目录中必须至少有一个基因表达（矩阵）文件（.gef）或者一个图像金字塔文件（.rpi）可用。

文件扩展名	描述
`.stereo`	是 JSON 格式的清单文件，包含实验信息、流程信息、基本的分析统计信息及 SAW 输出的图像和空间表达矩阵的映射信息的可视化文件。在SAW 输出的文件夹(`_visualization_`)中可找到一个`_.stereo_`的清单文件，StereoMap 支持打开 SAW 流程输出的可视化文件。
`.gef`	用于可视化的基因表达（矩阵）文件，是 HDF5 格式。包含每个 spot 点的每个基因的 MID 的个数。Spot 点是固定大小的正方形形状，基因在每个 spot 点的表达量在该正方形中的累计加和。默认情况下，可视化的`.gef`文件包含 bin1、bin5、bin10、bin20、bin50、bin100和 bin200的点。
`.cellbin.gef`	用于可视化的细胞特征的基因表达（矩阵）文件，是 HDF5 格式。它包含每个细胞的面积和空间位置，每个细胞中每个基因的 MID 的个数以及每个细胞所属的类群信息。在 `.cellbin.gef` 中，最小的单元为细胞。仅适用于SAW运行有图的流程
`.rpi`	`.rpi`文件以金字塔形式保存多种分辨率的图像，主要为更好的做可视化展示。每一个图像被降采样多个分辨率的图层，按照 256256 的像素进行切割并将图像碎片进行保存。若在当前分辨率下的图片尺寸小于 256ⅹ256，则无需切割。SAW 生成的`rpi`文件按照染色类型->图像类型->分辨率的顺序平铺展示，其中染色类型包括ssDNA、DAPI、H&E或者IF的名称，每个染色类型对应的图像类型包括配准图像、组织 Mask 和细胞 Mask，每个图像类型下对应有 bin 2、bin 10、bin 50 和 bin 100 分辨率的数据。可以在 StereoMap 的__可视化__模块打开图像数据。*
`<SN>.bin<N>_<leiden_res>.h5ad`	`.h5ad`文件以 AnnData 文件格式存储空间转录组的聚类信息，每一个`<SN>.bin<N>_<leiden_res>.h5ad`的文件只允许存储一个 bin 大小的分析结果。在生成的文件中，`<SN>` 代表 Stereo-seq 芯片序列号，`<N>` 代表 bin 大小，`<leiden_res>` 代表 Leiden 的分群颗粒度。在 SAW 标准分析中，默认的空间聚类分析使用的 binsize 为 200，Leiden 分群颗粒度为 1.0 。
`<SN>.cellbin_<leiden_res>*.h5ad`	`.h5ad`文件以 AnnData 文件格式存储细胞的聚类信息。在在生成的文件中， `<SN>` 代表 Stereo-seq 芯片序列号，`<leiden_res>` 代表 Leiden 的分群颗粒度，`` 表示可选内容，指是否做了细胞修正。如果`` 缺失，`.h5ad` 文件将对应的是基于细胞核覆盖区域的特征表达矩阵的聚类结果；如果 `` 被 `.adjusted` 替换，`.h5ad` 文件将记录基于细胞核修正后的特征表达矩阵的聚类结果，修正的逻辑为：在保证两个细胞不重叠的情况下，默认在原来细胞核的基础上外扩10 个像素。在 SAW 标准分析中，默认细胞聚类分析使用 1.0 的 Leiden 分群颗粒度进行处理。 SAW的标准分析流程中只有输入图像数据才会生成该文件，因细胞的位置信息是从显微镜的图像中获取的。*

可视化界面

如下图所示，展示了可视化模块的界面布局。

画布

如下画布展示了空间表达矩阵的数据按照点的形式叠加在 ssDNA 图像的组织切片上，其它工具悬浮在画布上。

Binsize 选择

点击 Binsize 的下拉列表为空间表达矩阵的热图选择合适的分辨率进行展示。

显示设置

这三个按钮主要调整画布的操作信息及组件的显示/隐藏，从左到右的依次说明如下：

设置：包含以下组件的开关及调整：比例尺、信息悬浮窗、图例、统计、聚类、缩略图和画布旋转。

撤回：返回上一步操作，最多可返回 10 步。
重置：清除当前所有操作，返回至文件打开时的初始状态。

操作工具

从左到右依次为：

游标：点击图标可退出手动操作的模式。
套索：使用套索工具手动绘制感兴趣的 ROI 区域。按住 Ctrl + 鼠标左键并移动鼠标开始圈选，点击 Enter 即可结束一次圈套。如果需要绘制多个区域，请松开鼠标左键，然后每次绘制时再次按住 Ctrl + 鼠标左键并移动鼠标开始圈选。套索功能可与新建 Group 组（参考 Group 章节获取更多信息）结合使用。可参考标注区域并生成新的热图或基于 H&E 图像的区域标注获取更多信息。
配准模板：单击配准模板按钮展示矩阵的 track 线模板，可用于辅助观察图像图层是否和表达矩阵配准。可以参考检查图像的配准获取更多信息。
测量：主要是测量两点之间的距离，单位为 PX (像素)。

导入及导出

导入及导出的选项如下：

导入：单击导入按钮，可以加载 lasso 或者差异分析的文件。
- 选择 Load a Lasso Record 加载 .lasso.geojson 文件，可以继续进行套索区域的修改。
- 选择 Load CSV File 加载差异分析的结果文件，将打开一个新的窗口展示 CVS 文件的内容。
导出：单击导出按钮，可以将当前画布上展示的图像保存至本地。
1. 输入自定义图像的文件名称。
2. 选择导出的图像类型：
- Screenshot Image ：当前画布的图像，截图的清晰度取决于当前使用电脑的分辨率。
- HD Image：当前屏幕图像的高清图。若开启了图例，则图例会单独作为一张图片保存下来。
- 选择 Export 您的图片将会自动通过网页下载。

缩放条

点击缩放条可以放大或者缩小画布的大小。

Feature 菜单

Feature 菜单显示了当前主分析图层基因/蛋白汇总的特征结果，点击菜单栏可以展开/折叠面板。面板中展示了特征（基因/蛋白）名称、MID 总数和 E10 三列信息，默认按照 MID 计数降序排列，但您可以点击每个表头右侧的小箭头，按所选列升序或者降序排列，E10 为该特征（基因/蛋白）的空间富集程度打分。您可以选择感兴趣的特征名称（基因/蛋白）来探索其表达情况。

搜索：您可以在搜索栏中输入基因/蛋白的名称，对基因/蛋白进行搜索（不区分大小写，支持模糊或者多名称搜索，多名称搜索需要使用英文逗号隔开）。

选择单基因/蛋白：点击某个基因/蛋白，该基因/蛋白对应的热图将会展示在画布中。
选择多基因/蛋白：勾选基因/蛋白名称前面的复选框，可以查看多个蛋白/基因的热图，当然您也可以通过不同的颜色特征探索它们之间的共表达（可参阅基因共表达分析获取更多详情）。

图层菜单及 Binsize 选择

图层菜单主要是控制数据在画布中的展示方式。

图层分为图像图层和主分析图层，binsize 选择提供当前数据的不同分辨率的展示。

图像图层展示的是跟表达矩阵配准后的影像图和分割后的 Mask（包括组织 Mask 和细胞 Mask ）。图层参数的调节会依据图像类型的不同存在差异，一般包括透明度、归一化、亮度、对比度和颜色等。归一化调整图像的最大和最小值，有助于可视化展示 track 线。计算公式如下：
𝑛𝑜𝑟𝑚=[𝑋𝑖−𝑚𝑖𝑛(𝑥)]/[𝑚𝑎𝑥(𝑥)−𝑚𝑖𝑛(𝑥)]
主分析图层包括表达矩阵的热图、聚类图或者 UMAP 图。聚类图和 UMAP 图只适用于有限的 binsize 图层，如想获取更多信息，请参考主分析图层展示选项。用户单击图层名称前面的图标可以打开一个新的链接子窗口，窗口间主要通过坐标联动，如想获取更多信息，可参阅微生物宿主分析获取更多详情。
当前数据的分辨率包括 bin1、bin5、bin10、bin20、bin50、bin100、bin150、bin200 以及cellbin（若该芯片有 cellbin 数据则包含，否则不包含）。Bin1 是每个 bin 中含有 1 个 DNB，cellbin 是基于细胞的维度对 DNB 进行分组，而 Bin5 则表示 5X5 个 DNB 作为一个分组的单元。自动-binsize 开关，如果您开启后，系统会根据画布放大系数自动切换 binsize。

主分析图层展示选项

主分析图层可调整的选项会依据不同的数据或者 bin 类型而不同。

热图图层可调整的选项包括：

热图选项	说明	Cell Bin
颜色	选择热图的配色方案
散点大小	调整热图的散点大小。	NA
透明度	调整热图的透明度以便更好的可视化展示。
MID 过滤	基于 MID 的计数过滤 spot点，有关更多信息请参考MID过滤。仅在勾选某个特征（基因/蛋白）后显示此选项。	NA
色阶尺	默认情况下，色阶尺的范围为 0~MID 的最大值，用户可以自定义色阶范围，以便更好的可视化。
边界	可以选择显示或者隐藏由表达矩阵生成的组织边界，边界分为：轮廓、填充和两者兼顾，其中填充的透明度是可以调整的。	NA
展示形式	仅在勾选某个特征（基因/蛋白）后显示此选项，即以热图和伪彩图形式展示。有关更多信息请参阅基因共表达分析。	NA

聚类图层可以调整的选项包括：

聚类&UMAP	说明	BinN	Cell Bin
透明度	调整聚类图层的透明度以便更好的可视化展示
细胞展示形式和轮廓颜色	细胞的展示形式可以设置为：填充、轮廓或两者兼顾。细胞轮廓颜设置为聚类的颜色、白色、黑色和绿色。	NA

Group 菜单

Group 包括两种类型： SAW 生成的组和用户自定义的组，其中 SAW 生成的组主要展示 SAW 流程生成的聚类文件，流程包括 SAW-ST-V8, SAW-ST-V8-realign，SAW-ST-V8-clustering及SAW-ST-V8-diffexp。

您可以在聚类图层下展示 SAW 生成的组，默认情况下，展示的是分群颗粒度为 1.0，binsize 大小为 200 或 cellbin（如果已经根据组织图像数据做了细胞分割）下的聚类数据。

效果增强：滑动滑块或者输入数值可以调整图像图层的透明度，以突出展示聚类图层。
复选框：点击聚类名称前面的复选框，可以展示/隐藏某个聚类。
颜色：点击右侧打开调色板，拖动拾色器上的小圆圈/彩虹带即可修改选中的聚类颜色。

您可以使用套索功能选择一个区域，为该区域命名，并将该区域分配给某个组（如果没有可选择的组名，可以直接创建新的组）。或者，您可以通过单击 + Create group 来创建新的组，并在保存套索标签时将标签分配给新创建的组。

点击更多图标可以编辑组的名称，或者按照 GeoJSON 的格式导出套索的区域并运行套索流程。您还可以点击Run differential expression 导出差异分析的参数并运行差异分析流程，请参考差异分析获取更多详情。

点击套索区域的名称，该名称及对应的套索区域会用黄色高亮展示，并在左侧浮动的面板中显示相应的统计信息。

生信分析

Stereo-seq T FF

检查图像的配准

芯片表面的轨迹线在空间表达矩阵热图上展示为较窄的线条，可将其作为参考辅助图像配准。强烈建议用户放大图像的组织边缘，通过查看轨迹线是否与图像上的暗线重叠，确定图像的配准效果。

检查是否对齐的一个小窍门，首先检查两个对角的区域，如果这两个区域的轨迹线跟图像的暗线完全重合，那么整体情况很可能是相对较好的。

如果大部分轨迹线不重叠，您将需要手动重新对图像做配准。具体操作步骤可参考图像处理指南。

注意

如果在某个视野中轨迹线完全重叠，但在其对角视野中不完全重叠，您可能需要检查下显微镜图像是否存在拼接问题。

基因共表达分析

您可以使用不同的颜色来可视化不同的基因，分析基因的共表达。

首先，在面板中选择感兴趣的基因，画布将展示该基因对应的表达热图。

其次，点击 Layer menu 菜单，在 Display Schemes 下选择 Multi-colored ，就可以比较您所选择的基因是否存在共表达。说明：下图已选定的基因在该组织中没有共表达。

如果对于系统默认分配的颜色或者显示设置不满意，可以点击所选基因对应拾色器上的小圆圈/彩虹带，打开图层设置面板做调整。

与之前的选择不同，这次我们选择了两个（黄色和紫色）共表达的基因如下图所示。

标注区域并生成新的热图

对组织样本中感兴趣区域的识别与分析，lasso 是一个很好用的工具，您可以在组织样本中手动勾画该区域，并将这些分散或者连续的区域归属在同一个组中。

如果您需要将某个区域增加到已知的 Label 中，可以简单地使用相同的 Label 名称来命名，系统将自动合并两个区域。

套索完成后，可以将坐标信息保存并传递给 SAW 重新分析，以获取所选区域的空间特征表达矩阵。

单击Group 或 Label 名称右侧的按钮，选择 Run lasso 导出套索的 GeoJSON 文件，并运行SAW-ST-V8-reanalyze-lasso流程，生成套索区域的空间特征表达矩阵，新生成的矩阵可用于后续进一步的分析。

您可以在数据管理的 /Files/ManualData/StereoMap/StereoMap_V4.0/Lasso 目录下找到输出的 <SN>.YYYYMMDDHHMMSS.lasso.geojson 文件，并在流程分析模块使用它再次运行SAW-ST-V8-reanalyze-lasso流程。

注意

为满足普通 bin 或 cell bin 下的计算，套索后的 GeoJSON 文件存储的是该区域下轮廓的坐标，而不是点的信息。

MID 过滤

在进行下游分析之前，对空间转录组数据进行预处理消除噪音至关重要，MID过滤功能主要用于手动去除每个选定特征的高/低表达的点，聚焦于其空间的分布。

该过滤功能可以单独调整选定的特征点，设置不同的阈值。阈值的的大小代表了过滤的数据范围，会随着bin的大小发生变化。因此建议您切换到后续计划分析中使用的 bin 大小再调整MID的阈值。

SAW-ST-V8-MIDFilter流程输出的矩阵包含每个特征过滤后的结果，可用于下游分析。

差异分析

注意

新功能，必须用 SAW >= V8.0 流程版本输出的可视化数据

差异分析模块通常针对聚类文件、空间区域标记或者Lasso 某个区域等进行。

对于聚类文件，可以点击右侧Group面板的选项，点击 Run differential expression，填写必要的参数信息并运行SAW-ST-V8-diffexp 流程分析结果。

对于Lasso 圈选某个区域，您需要在某个组中至少创建 2 个 Label 区域。

其次，点击右侧Group面板的选项，选择 Run differential expression，填写必要的参数信息并运到SAW-ST-V8-diffexp流程分析结果。

两种差异分析方法说明：

Label vs. others: 用来识别特定 Label 或者聚类跟其它所有 Label 或者聚类之间的差异分析。
Label vs. label: 用于识别特定 Label 或者聚类与已选择 Label 或者聚类之间的差异分析。

您可以在数据管理 /Files/ManualData/StereoMap/StereoMap_V4.0/Diffexp 目录下找到输出的差异表达分析参数文件，命名为<SN>.YYYYMMDDHHMMSS.diffexp.geojson 。

您还可在流程分析模块再次运行SAW-ST-V8-diffexp流程，将上述文件的路径作为参数做后续分析。

SAW 输出的差异分析结果文件（<bin_size>_marker_feature.csv），可以点击 StereoMap 的 Load CSV file （参考导入及导出）展示查看。

差异分析结果文件将会在一个新窗口打开，用户可以点击 L2FC 或者 p-values 的排序箭头对表格进行重新排序，以查看其显著特征。

点击表格中的特征名称，画布将会展示该特征对应的表达热图。此外，对于多个特征的分析，您可以通过不同的颜色展示他们，从而做基因共表达分析。

Stereo-seq N FFPE

基于 H&E 图像的区域标注

空间转录组可以在原始组织结构的背景下可视化基因表达热图，为从分子水平上挖掘组织的功能提供一定的指导意义。另一方面，H&E 染色可以提供组织结构和组织学信息的详细视图，整体着色可以显示细胞的总体布局和分布，使得病理学家能够轻松的区分细胞核和细胞质。

您可以基于病理组织学特征在 H&E 图像上标记感兴趣的区域，提取对应的表达矩阵数据，以全面分析组织的结构特征，可参考如下步骤：

首先，调整基因表达热图的透明度，确保 H&E 图像可以清楚的看到。

接下来，您可以使用 lasso 套索工具open in new window在 H&E 图像上进行标注（类似于标注区域并生成新的热图），按键盘的 Enter 键完成本次标注，点击 Save 保存标注区域的名称及归属的组即可。

如果您需要将多个区域标注在一个组中分析，只需保存的时候将他们归属到相同的组中。

退出 Lasso 并调整基因表达热图的透明度，可以查看在不同图层上展示的标注结果。

区域标注完成后，如果您需要获取所选区域的空间特征表达矩阵，可以单击右侧的按钮，选择 Run lasso 导出标注的区域文件并运行SAW-ST-V8-reanalyze-lasso流程。当然，如果您想要了解标注区域之间的差异，也可以选择 Run differential expressoin 。

您可以在 /Files/ManualData/StereoMap/StereoMap_V4.0/Lasso 目录下找到 Lasso后输出的 <SN>.YYYYMMDDHHMMSS.lasso.geojson 文件，或者在 /Files/ManualData/StereoMap/StereoMap_V4.0/Diffexp 目录下找到差异分析输出的<SN>.YYYYMMDDHHMMSS.diffexp.geojson文件，并在流程分析模块使用上述文件运行对应流程。

请参考标注区域并生成新的热图和差异分析了解如何提取空间表达矩阵文件或者运行差异分析。

微生物宿主分析

Stereo-seq N FFPE 产品可以通过随机探针捕获转录组+微生物的信息，在SAW-ST-V8的流程的 RefLibraries 参数，选择宿主和微生物的reference，可以输出宿主和微生物的空间基因表达矩阵。

在 StereoMap 的可视化模块，可以在 Microorganism 图层菜单查看微生物的矩阵数据，同时支持点击图层前按钮打开新的子窗口。

主窗口跟子窗口可以基于坐标点相互联动。在主窗口中，您可以选择某个聚类或使用 Lasso 高亮显示特定的区域，则对应子窗口会联动展示相应的内容。

如下图所示，主窗口显示了 bin 200 的聚类图，而子窗口展示了相同 binsize 的微生物表达热图。当您在主窗口中选择 Cluster 1 时，子窗口将联动展示相同坐标点的信息。在子窗口中，您可以再次使用 Lasso 功能展示该区域的的统计信息。

微生物按照分类的级别+双下划线+物种名称组成，比如 genus Mycobacterium 在 Panel 中可以写成 g_Mycobacterium，其中分类的级别为p（门），c（纲），o（目），f（科），g（属）和s（种）等首字母的缩写。

图像处理指南

图像处理的核心模块，您可以手动将图像与表达矩阵对齐，也可以使用图画工具编辑图像的 Mask 或者导入第三方工具生成的 Mask，手动操作完成可以将手动后的文件输入到 SAW 做后续分析。

为什么在空间分析中要使用图像数据

每一种组织在临床上的特征表达（如 mRNA 和蛋白质）可能不均匀，仅基于空间的表达信息去准确识别组织/细胞的边界将会具有较大的挑战。细胞核染色（比如 ssDN 荧光染色）或者苏木精-伊红（ H&E 染色）染色的组织图像在显微镜下可以清晰的显示整个组织区域，使用染色的图像可以显著改善组织或者细胞的轮廓信息。在确定组织边界后，可以将图像数据与空间表达分析的数据对齐，并利用边界信息获取组织或者细胞区域的热图，以进行更深层次的分析。

图像类型和格式

如下为 StereoMap V4.0和 SAW-ST-V8支持的数据格式说明：

Stereo-seq 芯片表面具有周期性的轨迹线（水平和垂直两个方向），在空间表达的热图上会展示为狭窄的线条，因轨迹线区域是没有捕获探针的，可以辅助矩阵跟图像的对齐。请严格参考 Stereo-seq 技术的组织染色和成像标准操作指南（SOPs），为最大程度地减小其对下游 mRNA 捕获率的影响并提高显微镜图像中轨迹线的可见性。在空间表达的热图和显微镜图像上可以同时看到这些轨迹线，故可以用作图像对齐的位置标记。

以下是图像和热图上的轨迹线示例。(图像的亮度做了调整，以便可以清晰的展示轨迹线。)

Stereo-seq 分析流程软件包（SAW）嵌入了自动化图像处理算法，用于识别组织和细胞的边界，并可以在Stereo-seq 芯片上检测到轨迹线，以便将图像与特征表达矩阵对齐。如果无法检测到轨迹线或组织/细胞边界不清晰，您可能需要手动处理。

图像处理用户路线图

推荐的图像处理用户路线图如下：

检查显微镜图像的质量。为简化后续的图像分析，强烈推荐在实验过程中做图像 QC，其目的主要确认是否可以检测到轨迹线，图像是否被准确的拼接，组织是否可见，最终为图像是否可以由 SAW 自动处理提供参考。

注意

云平台StereoMap V4.0暂不支持QC，请使用线下软件完成QC步骤。获取线下软件及有关 QC 评估指标和标准的信息，请参考 Image QCopen in new window获取更多详情。

图像与表达矩阵热图的配准。将图像与表达矩阵的热图重叠，可以调整图像的方向、尺度和角度等保证跟表达矩阵一致。对于多个免疫荧光（IF）的图像，请检查每个图像的配准结果。
圈选组织和细胞。使用绘图工具提取感兴趣的 ROI 区域或者上传第三方工具生成的组织/细胞的Mask。对于免疫荧光 IF 图像，可以通过调节阈值区间获得 ROI 区域，因信号较弱的区域很可能是背景。选择准确的组织/细胞区域，对于生成高质量的图像数据是至关重要的，可以降低图像背景噪声对于后续分析的影响。
导出操作记录文件。手动后的记录可以经过SAW-ST-V8-realign流程提取组织或者细胞区域对应的空间表达矩阵。

如下页面将按照 step by step 的方式，展示 Stereo-seq 支持的图像数据，请参考如下操作指南：

图像处理入口

以下几种方式均可打开图像处理：

在任务管理模块中，找到SAW-ST-V8流程所产生的任务，点击“图像处理”按钮，即可进入图像处理界面。
在交互分析模块中，从StereoMap V4.0启动页的Image Processing 进入图像处理。在数据管理页面，您可选择SAW-ST-V8流程输出的.tar.gz 或 .stereo 文件。

选择与您图像相匹配的类型，目前支持三种图像类型。

图像处理输入文件

SAW 嵌入了自动的图像处理算法，用于图像拼接（小图 FOV 拼接成大图）、组织分割、细胞分割及识别 Stereo-seq 芯片上的轨迹线（tracklines），可将图像与具有相同轨迹线的特征表达矩阵对齐。对于组织/细胞边界模糊或者算法无法自动检测到轨迹线的数据，可能需要您手动圈选组织/细胞轮廓或者对齐。

图像处理模块提供手动处理图像的一系列操作，主要包含手动圈选组织/细胞区域、导入第三方分割工具的Mask 结果以及手动将图像与特征表达矩阵对齐等功能。手动图像处理输入的数据为运行 SAW 自动图像算法后的数据。

文件扩展名 描述

.tar.gz 存储原始的显微镜图像及图像质控的信息。

线下小工具open in new window->图像质控->Image QCopen in new window生成的文件。

.stereo JSON 格式的可视化清单文件，包含 SAW 自动分析的图像结果文件及表达矩阵文件。

_.stereo_的清单文件可以在SAW 输出的文件夹（_visualization_）找到，如果_.stereo_作为图像处理模块的输入文件，该清单文件中至少包含图像（_.tar.gz_）文件和表达矩阵 (_.gef_) 文件的路径。SAW 输出的图像压缩文件_.tar.gz_记录了自动算法分割和配准的结果。

文件扩展名	描述
`.tar.gz`	存储原始的显微镜图像及图像质控的信息。线下小工具open in new window->图像质控->Image QCopen in new window生成的文件。
`.stereo`	JSON 格式的可视化清单文件，包含 SAW 自动分析的图像结果文件及表达矩阵文件。 `_.stereo_`的清单文件可以在SAW 输出的文件夹（`_visualization_`）找到，如果`_.stereo_`作为图像处理模块的输入文件，该清单文件中至少包含图像（`_.tar.gz_`）文件和表达矩阵 (`_.gef_`) 文件的路径。SAW 输出的图像压缩文件`_.tar.gz_`记录了自动算法分割和配准的结果。

核染色图像处理指南

为什么要做核染色图像?

核染色在组织切片中不存在组织分离偏倚，对于确定组织区域和细胞位置具有较高的价值。Stereo-seq 实验和生信分析工具同时兼容了 ssDNA 和 DAPI 两种核染色试剂。

STOmics 的研发团队测试并对比了多种商业化的染色试剂，发现 ssDNA 染色对下游 mRNA 捕获率的影响最小，DAPI 对染色细胞核具有高度特异性，可以与其它荧光试剂一起使用，是一种常用的染料。这两种染色方法都可以看到轨迹线。

核染色图像的注意事项

StereoMap 和 SAW 中处理的核染色图像为单通道的 8 位/ 16 位深的灰度图像，或者是 RGB 彩色图像。（有关更多信息，请参见图像类型和格式获取更多信息。）

荧光图像	数据类型和格式
灰度图像	8 / 16 位的单通道图像

第一步：上传图像

点击选择框中的 Choose file，选择一个兼容的图像文件，核染色图像类型仅允许上传一个图像文件。

请参考图像处理输入文件获取更多的图像文件信息。

选择文件后会触发一个文件解析的过程，该过程不仅会读取图像，还会从输入中获取必要的信息，解析的时间会因文件类型和图像大小有所差异。在图像处理步骤，Stereo-seq 芯片序列号（SN）和显微镜配置会提供重要的参考信息，如果输入的文件是.tar.gz 或者 .stereo，则信息已写入到输入文件中。

如果图像质控完成，您可以查看每个 QC 指标前指示器的状态。这些指示器与图像处理结果相关，您可能会在步骤标签上看到一些提示图标，指示某个步骤的潜在风险。

图标	说明
	完成。您已经完成了此步骤。
	警告。您可能需要特别注意这一步骤。图像质量对于自动操作来说并不理想。例如，如果您在第 2 步图像配准时看到此警告，这可能表明 SAW 中的自动配准可能出现了错误。需要您检查结果或者做手动调整。
	错误。您的图像有问题，无法在此步骤中处理。

第二步：图像配准

在该步骤中，您需要调整图像的方向、角度和尺度，以使其与空间特征表达矩阵对齐。

如果您在第一步中：上传了 .stereo文件，进入第二步时，您就可以同时看到图像和空间特征表达矩阵；上传了 .tar.gz 图像文件，在第二步您需要选择一个.stereo 文件来指定空间特征表达矩阵，可以点击选择 .stereo 文件。此外，如果您在第一步上传了.stereo 文件（包含图像文件），想更改第二步展示的空间特征表达矩阵文件，您可以点击重新加载一个新的矩阵文件，但还是使用第一步上传的.stereo的图像。

手动配准过程包括两个阶段：根据组织形态粗略的匹配图像的方向，然后精细调整图像的位置和尺度，确保与空间特征表达矩阵完全重叠。您还可以通过 Chip trackline，辅助进行精细对齐。

为了粗略对齐图像，您需要将显微镜图像与特征矩阵方向变换为一致。

使用翻转工具可以将图像绕Y轴镜像翻转。
点击旋转按钮使用可以将图像以相同的方向旋转。

当图像方向跟表达矩阵方向一致时，您就可以继续进行精细对齐了。

做精细配准时，您需要将图像移动到有组织覆盖的区域。

通过平移面板 设置移动的步长和移动的四个方向（上、下、左、右）。
因显微镜拍摄的图像数据的尺寸跟特征矩阵不同，您可以使用缩放工具来调整缩放的比例。

您可以勾选 Chip trackline 显示参考轨迹线模板，辅助对齐图像。此时，参考轨迹线模板可以作为矩阵的一种表示形式，如果轨迹线较暗，可以手动调整图像的归一化、对比度、亮度和不透明度等工具按钮。

注意

调整图像以便可以清楚的展示轨迹线。

注意

饱和度的调整对灰度图像不适用。

完成配准的图像将标记为已完成。

注意

如果做了手动配准，可以跳过步骤 3 和 4，您可以导出手动后的tar.gz图像文件，输入到 SAW 运行自动的组织分割和细胞分割。

另外，第五步的SAW-ST-V8-realign流程中会输出*regist.tif 图像文件，该文件是配准后的图像，其形状和方向跟基因表达矩阵相匹配，此图像可以作为组织分割或者细胞分割的起点。如果您考虑使用第三方分割工具，强烈建议使用此图像文件作为输入，避免图像与 Mask 之间存在位移、角度和尺度的偏差。

第三步：组织分割

注意

组织分割是可跳过的步骤。

在该步骤中，您需要识别组织区域，准确的识别组织边界可以减少背景干扰对于聚类结果的影响。基于图像的组织分割结果将映射到空间特征表达矩阵上，生成组织区域的表达热图。

注意

如果您在第一步中上传了.stereo文件，您可以在配准后的图像图层上看到一个半透明的组织掩膜。

如果是.tar.gz图像文件，您需要使用手动工具来绘制组织区域。

在该步骤中，您可以编辑之前记录的组织掩膜或创建一个新的掩膜。如果是.tar.gz或.stereo文件中记录的组织掩膜将会在 Segmentation mask 下拉菜单中标记为 RECORD ，而通过手动绘制或导入创建的掩膜将标记为 CUSTOM 。如需更在画布显示的掩膜图像，只需从 Segmentation mask 下拉菜单中进行选择切换即可。

如果需要编辑组织区域的掩膜图像，可以使用套索、画笔和橡皮擦等工具。套索一般用于选择或剔除大面积区域，而画笔和橡皮擦工具更适合于编辑组织周围或组织中的小孔等较小的区域。

您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

第四步：细胞分割

注意

细胞分割是可跳过的步骤。

细胞分割是生成单细胞空间分辨率数据的核心步骤。

注意

如果您在第一步中上传了.stereo文件，您可以在配准后的图像图层上看到一个红色的细胞/细胞核掩膜。

如果是.tar.gz或.tif/.tiff图像文件，您需要使用手动工具来绘制细胞。

因只在组织区域的范围内展示对应的细胞分割结果，组织外的区域将会展示为黑色的背景。

类似组织分割，您可以选择编辑之前已经记录的掩膜（标记为 RECORD ）或创建一个新的掩膜（标记为 CUSTOM ），可以通过从 Segmentation mask 下拉菜单中切换画布中展示的掩膜类型。

使用套索、画笔和橡皮擦工具来编辑细胞。套索最适合用于取消大面积的背景，而画笔和橡皮擦工具更适合于较小的区域，例如标记某个细胞。

建议您使用配准后的图像导入到第三方分割工具创建.tif格式的二进制细胞掩膜文件。您可以通过单击右侧面板上的 Segmentation mask 下拉菜单，单击来导入第三方分割工具创建的.tif格式的二进制掩膜文件，如果对于导入的结果不满意，您可以单击来替换新的掩膜文件。

第五步：保存&运行

最后根据手动调整的结果投递流程。单击 Save&Run 系统将生成一个.ipr文件（保存至以下路径：/Files/ManualData/StereoMap/StereoMap_V4.0/ImageProcessing/），并自动调起SAW-ST-V8-realign流程，输入对应参数，点击运行即可。此外，用户还可进入流程分析模块，使用上述.ipr文件自行投递SAW-ST-V8-realign流程。

核染色 + 免疫荧光图像处理指南

为什么要做核染色+免疫荧光图像?

免疫荧光（immunofluorescence, IF）是一种广泛使用的基于图像的技术，用于可视化展示细胞中蛋白质的亚细胞分布，例如，细胞核可以用 DAPI 染色，而 T 细胞可以通过 CD3 识别。多重免疫荧光（multiplex, mIF）可以标记在组织切片上通过荧光显微镜同时扫描，Stereo-seq 生化流程和生信分析工具兼容 DAPI 和最多 6 个用户定义的 IF，从而实现对组织样本更多的空间研究。

核染色+免疫荧光图像的注意事项

由于每个免疫荧光（IF）都具有特定的荧光光谱，并且它们都同时应用于同一组织切片上，对于 IF 的选择和显微镜成像系统两个方面都具有较大的挑战。因此管理您选择的 IF 之间的光谱重叠程度至关重要，另外成像系统可用的激发波长和发射波长也要考虑。

荧光显微镜通过两种方法扫描带有 IF 标记的组织区域：在相同扫描区域切换滤光片，直到扫描完整个组织区域，或者在扫描整个组织区域后切换滤光片。这两种方法都需要在每次扫描之间保持芯片不动，以确保IF图像中的组织位置在角度和尺度方向上保持一致。

StereoMap 和 SAW 中处理的 DAPI + mIF 图像为 8 位/16 位深的灰度图像。（有关更多信息，请参见图像类型和格式）

荧光图像	数据类型和格式
灰度图像	8/16位的单通道图像