Q
透化酶可以振荡混匀并短暂离心吗？
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A
不可以振荡混匀，需要移液器吹打混匀。可以进行瞬时离心。
Q
透化实验中，若透化试剂150 μL无法完全覆盖整张芯片如何处理？可以多加一些透化试剂吗，是否有风险？
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A
滴加试剂时，建议先在芯片四角滴加，然后在芯片中央滴加，未覆盖完全的部位可用枪头轻轻引流，需注意此过程不能碰触到组织。若滴加量不够，在实验时可适当增加，但需考虑潜在风险。经测试，在载具上增加透化反应液的体积会影响组织的覆盖率。结果发现，透化反应液增加后，高表达的组织（如：睾丸）组织覆盖率会降低约10%，小鼠脑样本的变化不大，降低约3%。
Q
透化实验和转录组实验中，为什么只有透化步骤封板模不用撕开粘贴到载具上？
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A
使用封板模的目的是为了防止反应液体蒸发，影响PCR仪器的运作。透化步骤不撕开膜的原因有：（1）该步骤反应时间短、反应温度低，不用紧密封口；（2）透化实验加液次数多，反复撕膜操作不便。
Q
时空转录组FF进行组织透化测试的作用和原理是什么？
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A
组织透化是通过透化酶改变细胞膜的通透性，使组织细胞内的mRNA释放出来的过程。进行组织透化测试实验主要作用是为了获得对应组织的透化酶的最佳作用时间，为后续转录组实验提供合适的透化反应时间。
Q
时空转录组实验中气瓶吹干芯片时，如何避免喷出液体？如果没有气瓶可以晾干吗？
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实验过程中，先用气瓶放一段气，确保出气的力度大小合适，速度平稳后再吹干芯片。
建议按照试剂盒使用说明书使用气瓶吹干，如果没有气瓶，可用小风扇吹干，自然晾干会有盐渍残留。若盐渍残留过多，会将Track线覆盖，导致Track线无法拍清，影响QC结果。
Q
如何确定时空转录组FF透化测试实验的透化时间选择范围？大尺寸芯片可以参考1 cm × 1 cm芯片的透化时间梯度来设置吗？
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A
可以参考同类型样本以往的测试结果，如鼠脑一般选择6 min、12 min、18 min、24 min作为透化梯度。
大尺寸芯片可以适当参考1 cm × 1 cm芯片的透化结果设置时间梯度，但不能直接沿用1 cm × 1 cm芯片透化时间来做转录组实验。
Q
组织样品切片大小该怎么选择？组织太小怎么办?
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建议目标组织区域最多不要超过整张芯片的80%，给贴片留出一定容错空间；同时，组织不要太小，会导致mRNA总量不满足建库需求，浪费芯片空间。如果组织太小，可以选择小规格的芯片比如0.5 cm × 0.5 cm芯片来进行时空实验。
Q
甲醇固定的目的是什么？为什么甲醇预冷时间有限制？
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甲醇固定的原理是甲醇脱水，沉淀蛋白质从而形成分子间交联，固定组织状态和RNA相对位置。甲醇预冷时间限制的原因是：（1）时间过短，甲醇未达到-20°C，会影响组织mRNA质量；
（2）甲醇预冷时间过长，若盛放容器密闭性很好，则不影响固定效果；若容器密闭性差，则甲醇会吸收空气中的水分，导致浓度下降影响固定效果。
Q
时空转录组 FF V1.3实验流程中烤片的目的是什么？
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A
OCT是聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物，具有粘合剂的作用，37℃条件下烤片，OCT由固态变为液态，可增加组织切片与芯片的贴合程度，降低脱片风险。另外，甲醇固定在-20℃条件下进行，如果不烤片，贴片后立刻固定，没有温差的作用，增加脱片风险。
Q
怎么判断切片和芯片是否完全贴合？
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A
烤片过程中在光线明亮处观察，切片有裂痕、空腔皆会显示出芯片的底色，比成功覆盖上组织的部位更黑。烤片结束，组织和OCT中的水分挥发完全后，贴有组织处呈现白色。
