Q
转录组实验为什么需要甘油封片？甘油若不能覆盖整张芯片，应如何操作？
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A
甘油封片的成像效果更佳。若甘油未完全覆盖整张芯片可按以下操作：（1）可以适当从芯片和盖玻片缝隙、甘油未覆盖处加一些甘油（1-2 μL），可以达到完全覆盖的效果；（2）如果甘油在盖玻片一侧溢出，另一侧甘油没有完全覆盖芯片，可以考虑轻微挪动盖玻片，保证整张芯片覆盖完全甘油（存在剐蹭组织风险，对操作要求高）。
Q
组织荧光染色液是染细胞膜还是细胞核的染料？有没有染细胞膜的染料？例如橙色的Dil、绿色的 Dio、红色的DiD、红色的Alexa Fluor 555 Phalloidin等。
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A
组织荧光染液为细胞核染液。
目前暂时没有成熟可用的细胞膜染料。橙色的Dil、绿色的 Dio、红色的DiD、红色的Alexa Fluor 555 Phalloidin这些染料都需要测试，确认是否可以准确识别细胞边界，是否影响时空芯片的捕获。
Q
是否可以直接使用已有经验的透化时间，不再进行透化测试时间摸索？
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不可以。不同物种同一组织类型、或相同组织类型的不同样本，直接使用以往的透化时间进行实验是不可取的，透化时间的长短与样本的异质性、取样条件、物种特异性、细胞类型、细胞排列方式以及致密程度等都有关系，所以同一组织不同位置的透化时间都可能不同。可以参考以往经验设计透化测试的时间范围，但真实实验的开展还是要以样本的透化测试结果为准。
Q
透化酶可以振荡混匀并短暂离心吗？
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不可以振荡混匀，需要移液器吹打混匀。可以进行瞬时离心。
Q
透化实验中，若透化试剂150 μL无法完全覆盖整张芯片如何处理？可以多加一些透化试剂吗，是否有风险？
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A
滴加试剂时，建议先在芯片四角滴加，然后在芯片中央滴加，未覆盖完全的部位可用枪头轻轻引流，需注意此过程不能碰触到组织。若滴加量不够，在实验时可适当增加，但需考虑潜在风险。经过我们测试，新鲜样本-载具上透化体积增加对覆盖率存在影响。高表达的组织例如睾丸透化体积增加覆盖率降低10%左右；鼠脑样本透化体积增加覆盖率差异不大，降低3%左右。
Q
透化实验和转录组实验中，为什么只有透化步骤封板模不用撕开粘贴到载具上？
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A
使用封板模的目的是为了防止反应液体蒸发，影响PCR仪器的运作。透化步骤不撕开膜的原因有：（1）该步骤反应时间短、反应温度低，不用紧密封口；（2）透化实验加液次数多，反复撕膜操作不便。
Q
时空转录组FF进行组织透化测试的作用和原理是什么？
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A
组织透化是通过透化酶改变细胞膜的通透性，使组织细胞内的mRNA释放出来的过程。进行组织透化测试实验主要作用是为了获得对应组织的透化酶的最佳作用时间，为后续转录组实验提供合适的透化反应时间。
Q
时空转录组实验中气瓶吹干芯片时，如何避免喷出液体？如果没有气瓶可以晾干吗？
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A
实验过程中，先用气瓶放一段气，确保出气的力度大小合适，速度平稳后再吹干芯片。
建议按照试剂盒使用说明书使用气瓶吹干，如果没有气瓶，可用小风扇吹干，自然晾干会有盐渍残留。若盐渍残留过多，会将Track线覆盖，导致Track线无法拍清，影响QC结果。
Q
如何确定时空转录组FF透化测试实验的透化时间选择范围？大尺寸芯片可以参考1 cm × 1 cm芯片的透化时间梯度来设置吗？
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A
可以参考同类型样本以往的测试结果，如鼠脑一般选择6 min、12 min、18 min、24 min作为透化梯度。
大尺寸芯片可以适当参考1 cm × 1 cm芯片的透化结果设置时间梯度，但不能直接沿用1 cm × 1 cm芯片透化时间来做转录组实验。
Q
组织样品切片大小该怎么选择？组织太小怎么办?
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A
建议目标组织区域最多不要超过整张芯片的80%，给贴片留出一定容错空间；同时，组织不要太小，会导致mRNA总量不满足建库需求，浪费芯片空间。如果组织太小，可以选择小规格的芯片比如0.5 cm × 0.5 cm芯片来进行时空实验。
