Q
甲醇固定的目的是什么？为什么甲醇预冷时间有限制？
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甲醇固定的原理是甲醇脱水，沉淀蛋白质从而形成分子间交联，固定组织状态和RNA相对位置。甲醇预冷时间限制的原因是：（1）时间过短，甲醇未达到-20°C，会影响组织mRNA质量；
（2）甲醇预冷时间过长，若盛放容器密闭性很好，则不影响固定效果；若容器密闭性差，则甲醇会吸收空气中的水分，导致浓度下降影响固定效果。
Q
时空转录组 FF V1.3实验流程中烤片的目的是什么？
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OCT是聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物，具有粘合剂的作用，37℃条件下烤片，OCT由固态变为液态，可增加组织切片与芯片的贴合程度，降低脱片风险。另外，甲醇固定在-20℃条件下进行，如果不烤片，贴片后立刻固定，没有温差的作用，增加脱片风险。
Q
怎么判断切片和芯片是否完全贴合？
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烤片过程中在光线明亮处观察，切片有裂痕、空腔皆会显示出芯片的底色，比成功覆盖上组织的部位更黑。烤片结束，组织和OCT中的水分挥发完全后，贴有组织处呈现白色。
Q
时空转录组FF实验中，贴片操作时冷贴与热贴的区别？
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冷贴与热贴各有优缺点，可根据个人经验选择。冷贴便于大尺寸组织贴片，可以调整组织在芯片上的位置，利于展片。热贴不需要预冷芯片，一般适用于相对平整的小组织切片。
Q
贴片前芯片预冷后表面结霜，该如何解决？
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已经结霜的芯片拿出来烤干，后续尽量避免长时间预冷导致结霜，若操作不能很好控制时间，请不要放在温度很低的地方。此外，还需注意不要将芯片长时间放在切片机开口正下方，否则冷热空气在开口处交汇更易产生冰霜。
Q
时空转录组FF实验切片厚度要求必须是10 μm吗？可否调整？肝组织20 μm是否可以？
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不同组织或同一组织不同区域，其细胞大小各有差异，目前按照一般尺寸单层细胞计算大多数样本建议厚度是10 μm。过薄增加切片难度，相对厚切片而言，基因捕获量降低；过厚有脱片的风险，且会有细胞层叠的风险，不利于细胞分割。对于不同物种，我们做过的切片厚度范围在5-30 μm之间，您可以根据具体情况测试优化后选择。
Q
实验过程中发生切片厚度不均一如何处理？
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请从以下三点确认：
（1）样品托与样品发生松动。此情况可把样品托取下，将包埋块重新固定在样品托上；
（2）样品托后有杂质。请取下样品托清理后重新安装；
（3）可能两张切片时间间隔过久，组织表面温差发生改变导致厚度有些微差异。建议合理进行切片安排。
Q
新鲜组织OCT包埋样品中的冰晶是如何形成的，如何预防冰晶的产生？
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样品中的冰晶主要有两种情况：
1、组织内部的冰晶，组织内的冰晶主要是包埋时组织块降温不够迅速，导致组织内的水分凝结成冰晶。可以从两方面来降低发生概率：
（1）可以把组织切小一些（满足实验需求即可），使组织内部降温时间变短；
（2）组织放入OCT后进行干冰速冻时，尽可能将包埋盒四周放置在干冰中，加快降温速度可以减少冰晶产生；大块的组织推荐使用乙醇浴来降温。
2. 组织外的冰晶，通常是组织清洗带来的液体没有擦干导致，这种情况可不对组织进行清洗。
Q
组织周围的OCT会影响质检结果吗？
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过量的OCT会影响RNA提取和RNA质检的结果。在组织包埋过程中，过量的OCT还会挤压组织致使形变，特别是小组织样本。因此建议组织包埋只取适量的OCT，在切片质检时可以修去多余的OCT。
Q
检测RNA完整性必须用Agilent 2100吗？
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推荐使用Agilent 2100。Agilent 2100是大多技术普遍应用和公认的标准，灵敏度高，只需1 μL（0.1-50 ng/μL）的RNA即可。
