• 细胞分割的效果受到显微镜拍照的情况和分割算法等多重因素的影响。拍照时如果存在组织过曝、模糊等因素，会影响算法识别细胞，导致无法分割。对于密集区域本身清晰度不够，并且可能存在细胞重叠的情况，那么也会导致算法难以识别。如果图像中组织不同区域局部亮度不均匀、或者存在实验导致的拖尾、背景存在杂质等情况，也会导致分割错误。（部分示例见下方）详细信息请查阅《Stereo-seq 空间多组学技术成像指南》。

  
  

• 从算法本身来讲，因为分析流程的自动分割算法是基于人工标注的数据集，学习训练而来，所以一些非常少见的细胞形态未能涵盖进数据集中，也可能会导致算法无法准确识别出细胞。

  
  

• 如果自动算法分割效果不佳，可以尝试使用 StereoMap 桌面端图像处理软件进行手动调整，也可以尝试用其他算法重新分割，将分割后的 .tif格式的二进制细胞掩膜文件重新导入 StereoMap 做后续分析。详细操作请查阅《StereoMap 用户手册》>图像处理指南>核染色图像>#第四步：细胞分割。

注：每个染色类型推荐的分割算法可参考：CellBinDB：大规模多模态数据集助力细胞分割模型开发与评估

https://stomics.tech/col64/1470

• SAW >= 8.0：

• 使用预封装的pipeline进行分析，使用方式请查阅《SAW 用户手册》。

• SAW < 8.0：

• 请登录时空组学官网：https://www.stomics.tech/products/BioinfoTools/OfflineSoftware/SAWOperationManual 下载查阅SAW详细说明书。

• GitHub链接：https://github.com/STOmics/SAW。

Reference & GTF/GFF注释文件

Q：在时空组学分析中，对基因注释文件GTF/GFF格式的要求是什么？

1. 文件格式：

1. GFF文件 或者 GTF文件，文件后缀名支持 gtf/gtf.gz，gff/gff.gz，gff3/gff3.gz

2. GTF文件格式：

1. 注释行以 # 开始

2. 主体部分共 9列，以tab作为分隔符：seqname source feature start end score strand frame attributes

• type：注释信息的类型必须含有gene,transcript 和 exon
  

• start/end：最大值需小于2^{31}

• strand：链的正向与负向，分别用加号+和减号-表示。

• 第9列为attributes，格式为tag "value"（标签“值”），不同属性之间以空格相隔 ; 必须要有以下4个

• gene_name value

• gene_id value: 表示转录本在基因组上的基因座的唯一的ID。gene_id与value值用空格分开，如果值为空，则表示没有对应的基因。

• transcript_name value

• transcript_id value: 预测的转录本的唯一ID。transcript_id与value值用空格分开，空表示没有转录本。

c. 目前最大有效基因数必须小于2^{20}，即1048576

d. 不可以乱序，即同一个gene的transcript/exons需按顺序排列

3. GFF文件格式：

a. 注释行以 # 开始

b. 主体部分共 9列，以tab作为分隔符：seqid source type start end score strand phase attributes

• type：注释信息的类型必须含有gene, mRNA和 exon

• start/end：最大值需小于2^{31}

• strand：“＋”表示正链，“－”表示负链，“.”表示不需要指定正负链，“?” 表示未知

• 第9列为attributes，格式为tag=value （标签＝值），不同属性之间以分号相隔

  - 需要存在ID Name Parent(对gene无需判断Parent)

  - 对于第三列的命名规则请务必仔细研究 ⇒ “树状分级” （不能只列出child行 而没有parent行！）示例如下：

c. 目前最大有效基因数必须小于2^{20}，即1048576

d. 可以乱序,但仍需满足 gene必须出现在对应mRNA之前,mRNA必须出现在对应的exon之前的规则

4. 其他注意事项：

1. gene/gene_name(基因的名字) 值不含有特殊符号（空格，各类型括号，引号，<>，%等）。支持使用的常见特殊符号有”_“，"."。

2. gene/gene_name(基因的名字) 值长度小于64个字符

3. 虽然GFF文件现在大部分使用的都是第三版（GFF3），但是文件命名时请命名为.gff ；同理对于GTF文件也请在文件命名时采用.gtf
   

• HTML报告中的饱和度分析可评价测序数据的整体质量，为提高计算效率，在指定bin size维度下从成功注释reads中进行小样本随机抽样，故同一数据多次运行的结果可能略有区别，但曲线整体形态一致。

• 图1：随机抽样数量增加，bin200维度下的基因中位数逐渐增加。

• 图2：根据随机抽样样本的Unique Reads数据拟合而出的曲线。

• 图3：对抽样样本中的Unique Reads(CID、gene和MID都唯一的reads)进行统计，饱和度值=1-(Unique Reads)/(Total Annotated Reads)，随着抽样量增加，拟合曲线近平缓代表数据趋于饱和，是否加测需根据项目整体设计和样品情况而定，例如珍贵样品建议可加测。

注：三张图片的x轴相同，y轴分为基因中位数、Unique Reads和饱和度值

StereoMap 是一款无需编程的桌面端软件，支持 Stereo-seq 数据交互式的可视化及图像数据的手动分析。上游分析中，Image QC 工具评估图像是否可以调用 SAW 自动的图像分析算法，使用 Image Processing 手动配准或圈选组织/细胞。

注：ImageStudio 已合入 StereoMap (≥4.0)