时空组学FAQ_时空组学常见问答_时空组学资源_STOmics

Q 华大时空组学技术Stereo-seq配套的线下分析软件ImageQC/Imagestudio、SAW以及StereoMap 使用时有哪些注意事项？展开收起

A

需要注意：一、新版本软件可兼容旧版本功能；二、三个软件必须配套使用，即软件的不同版本号之间需要配套。现有不同版本号间的配套规则如下：

imageQC	ImageQC描述	SAW	SAW描述
<= 1.0.8	文件格式：.json + .tar.gz描述：ssDNA图像QC	<= 4.1.0	支持组织分割和ssDNA图像配准
>= 1.1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA图像QC	>= 5.1.3	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析
ImageStudio	ImageStudio描述	SAW	SAW描述	StereoMap	StereoMap描述
1.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA图像QC及手动处理	>= 5.5	支持ssDNA图像细胞分割；支持Q4 FASTQ数据分析；	1	支持空间表达热图展示；基因分布megre展示；ssDNA图展示及手动配准；
2.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理	>= 6.0	支持mIF配准；支持rRNA过滤	2	mIF图展示；mIF图merge展示；
2.1	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1< 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1< 3.0	支持多gef一次性读入，通过切换标签展示
2.2	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	>= 6.1< 7.0	支持ImageStudio全手动处理图像接入流程；	2.1< 3.0	支持多gef一次性读入，通过切换标签展示
3.0	文件格式：.ipr + .tar.gz描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理；及QC失败图像的全手动处理；	7	count重构上线register重构，升级组织分割和细胞分割V03算法。支持H&E全流程处理支持基于细胞分割的mask图像结果，使用EDM算法进行细胞修正。	<=3.0	支持读入不同binsize/resolution的h5ad；cgef文件跑过SAW cellChunk模块后写入/codedCellBlock信息，加载cgef时支持渲染cellbin热图
3.0		7.1	支持时空蛋白试剂盒分析，可获得蛋白表达矩阵支持蛋白组和转录组联合分析	3.1	支持蛋白+转录试剂盒分析结果可视化支持主副窗分别展示不同组学，或分别展示热图和聚类图支持主副窗联动展示
已与StereoMap合并	文件格式：.tar.gz（包含.ipr）描述：ssDNA、DAPI、H&E、mIF图像QC及手动处理，以及QC失败图像的全手动处理；	8.0	使用pipeline进行分析；支持FFPE样本分析（包含微生物部分）；输出报告压缩包文件输出可视化压缩包文件；	4.0	图像可视化：支持使用.stereo统领文件读取；兼容旧版本数据读取；手动处理：使用step by step方式处理图像数据
已与StereoMap合并		8.1	支持Stereo-seq T FF V1.3和Stereo-CITE T FF 样本分析	4.1	图像可视化：支持展示 Cellbin 的单/多基因热图；支持蛋白&Marker 基因的多组学联动展示；手动处理：增加空芯片打点配准（无需矩阵）；输出文件支持用户自定义目录。

Q rRNA的比对如何在分析过程中去除？是否可以手动设置需要去除的rRNA序列？展开收起

A

此功能的使用需根据SAW版本进行区分。

SAW >= v8.0：

①使用SAW makeRef构建比对所需的参考基因组索引文件，若需进行rRNA去除，需要在构建时设置--rRNA-fasta参数，自动添加rRNA信息并构建索引文件。

②运行SAW count时开启--rRNA-remove参数即可，并且使用添加了rRNA信息的索引文件。

③去除rRNA的步骤细节和原理详见《SAW 用户手册》>使用教程>比对索引构建>#SAW makeRef>##转录组比对>###添加 rRNA 信息至参考基因组。

SAW < v8.0：

①可以在参考基因组FASTA文件中手动添加rRNA序列，重新构建reference index后，再在SAW运行mapping时打开rRNAremove开关，过滤掉比对上rRNA序列的reads。rRNA过滤功能在SAW v6.0版本新增。

②添加rRNA序列规则：在FASTA文件中增加待过滤的rRNA序列，“>”开头的序列名称需要在第一个部分的名称最后增加“_rRNA”，用于程序识别。示例如下：

5eecdaf48460cde597a98a21623c3e677bdf515d479ad2214e47bcdad4e608bc2bf3b0078b9fb6c839e8703ac5556d0d718780e9e3cc06fe46e1353cea9e5d502a881532c0d1bab4b2d4d47cb1cc505d08cf75a52f134f4b4bd6b5792c76823f

③运行SAW mapping时在bcPara文件中增加一行，输入"rRNAremove"。示例如下：

bcPara file

in=<mask>

in1=<lane_read_1.fq.gz>

in2=<lane_read_2.fq.gz>

barcodeReadsCount=<lane.barcodeReadsCount.txt>

barcodeStart=0

barcodeLen=25

umiStart=25

umiLen=10

umiRead=1

mismatch=1

bcNum=<CIDCount>

polyAnum=15

mismatchInPolyA=2

rRNAremov

④如果query read比对上rRNA，其比对记录第三列RNAME为参考基因组中添加了"_rRNA"尾缀的序列名称，第十二列Optional fields的XF:i标签为3。后续注释时，根据XF标签的记录，统计rRNA的比例。

微信截图_20240812174341

Q 为什么在 StereoMap 的转录组分析图层会看到两个热图？展开收起

A

StereoMap v4.0 版本后默认展示组织区域的热图，如果运行 SAW v8.0 软件进行分析时没有输入显微镜图像，程序会基于表达矩阵信息进行组织分割，如果分析人员对自动算法提取的组织内矩阵不满意，可能需要基于整张芯片的表达热图重新进行组织区域的圈选（使用lasso工具），故此场景下，在 StereoMap 中会看到全芯片和组织区域两个范围的转录组热图。

Q 为什么在 StereoMap lasso 前后 MID 统计信息会有部分差异？展开收起

A

主要原因为 StereoMap lasso 统计信息与 SAW lasso 生成的矩阵计算数值的逻辑不一致：

lasso 的统计信息：首先判断当前圈选的区域的 sport 点是否过 bin 的中心，如果过了 bin 的中心，则统计该 bin 的信息；否则不统计。
SAW 提取矩阵：首先将圈选的轮廓区域转换为 bin 1 ，即最小的颗粒度，再从 bin1 转换为其它大 bin。

微信截图_20240812172554

微信截图_20240812172611

Q 在 StereoMap 中可视化查看结果时，发现自动配准的情况下，图像边界外出现基因表达现象，是否正常？展开收起

A

微信截图_20240812172432

这种情况是正常的，以上图为例，图为图像+矩阵热图的可视化展示，原因主要有两点：一，由于样本切片位于芯片边缘，图像组织分割结果会生成在矩阵外周，造成“外溢”的假象；二，在观察矩阵热图时通常选择bin20或者bin50（将其视为一个spot单位点）的bin size尺寸，bin的坐标位点计算是取其左上角顶点，当实际表达只占spot单位点的一小部分时，可视化展示也会将整个spot点亮，所以矩阵边缘看起来像是“外扩”。

Q SAW分析完成会产生多个GEF文件，分别记录了哪些信息？是否支持可视化？展开收起

A

GEF是一种分层结构的数据文件格式（本质是HDF5文件），支持灵活保存不同bin size的稠密矩阵和稀疏可视化矩阵，来适配数据存档和可视化展示的多种场景。具体每个GEF根据使用场景和频率，不一定包含可视化必需的稀疏矩阵，以降低存储压力。

SAW >= 8.0

详细信息请查看《SAW 用户手册》>运行分析>输出结果>Matrices。

SAW < 8.0

微信截图_20240812172301

Q SAW分析任务如果意外中断了是否可以断点重启？展开收起

A

使用 SAW >= 8.0 运行SAW count分析流程时，如遇到因集群意外停机、环境kill任务或者队列爆内存情况，在重启集群/服务器后，重新提交任务，程序可以rerun分析，但是要求两次分析任务的命令参数完全一致，不可有任何更改，程序会对此进行校验，如有区别，会当成第二次不同的任务启动。

注：此功能不适用于参数设置错误，或者输入数据错误等人为因素引发的问题。

Q 一个细胞的大小和square bin size的关系是怎样的？展开收起

A

以一个细胞的直径为10 μm左右计算时，一个细胞约相当于bin20（10 μm x 10 μm）或 bin14（取diagonal = 10 μm）。

Q Bin是方形区域还是指圆形区域？分析时如何选择合适的Binsize? 展开收起

A

Bin是芯片上规整的N × N的方形区域，区域内表达信息汇总就是Bin的表达信息，注意不包含正方最右侧边和最下方边的DNB点（Bin1除外）。

可以按照不同组织类型的细胞大小等，根据下游分析效果多次调试Bin20、50、100、200数值。其中Bin20与动物细胞大小近似，Bin50和Bin100是常用于分析的Binsize大小，Bin200一般用于快速可视化效果展示。

Q Valid CID比例异常应该怎么处理？展开收起

A

Valid CID rate低可以排查的方向有3个：

1. 测序情况。测序质量低会影响比对结果。除了Q30还需要检查call N的情况，可以查看下机报告的base distribution，如果出现N碱基的比例高的情况，就需要考虑是因为测序问题，影响了valid CID rate，最好优先排查。

2. 芯片mask h5文件和fastq不对应。因为mask里记录的CID和对样本测序得到的CID不匹配，导致valid CID rate低。这个情况如果单一出现，一般比例极低，但如果涉及到后一个情况，比例波动比较大，需要酌情判断。

3. 污染/混样。在实验过程中或者建库测序的时候混入了其他样本，因为受到污染，所以影响了valid CID rate。那么可能存在两张芯片，同时可以和这个文库的下机数据比对上。如果混的比较多，可以有明确的组织pattern，如果比例极小，有的情况下会有部分高亮点。