时空组学FAQ_时空组学常见问答_时空组学资源_STOmics

Q 进行时空转录组的石蜡样本对包埋的方法有要求吗？常规石蜡包埋是否可以？展开收起

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时空转录组对于包埋方法无特殊要求，按照常规蜡块制备方法即可，实验开展前会进行质检，DV200>30%即可进行时空实验。

Q 时空转录组FF透化测试实验中拍照的结果如何分析? 展开收起

A

透化测试的主要作用是判断组织样本的适用性以及摸索组织样本的透化条件。荧光拍照时需要统一曝光时间、亮度和对比度，在统一拍照结束以后，为了更直观地判断不同透化时间组织样本的荧光拍照表现，建议使用 imageJ软件进行处理。

处理方法： 将拍好的不同透化时间的图片统一拖入 lmage J 软件，在菜单栏中选择Image -> Stacks -> Stack to lmages(也可以按快捷键 F2合并)，点击 OK 合并图片后，就可以统一调整图片参数。在菜单栏选择 Image -> Adiust->Brightness/Contrast，可以直接按 Auto 自动调整统一的参数。按键盘的左右键可以切换图片。如果不满意 Auto 调整的结果，可以按 Reset 重置参数，手动进行调整，直至选到对比明显的一组参数。选取组织轮廓最清晰，荧光信号最强的拍照结果的条件作为最佳透化条件，得到的透化条件可以是一段时间范围，如 9-12 min。

Q 时空蛋白转录组Stereo-CITE的优势是什么？展开收起

A

Stereo-CITE是基于测序的空间原位捕获技术，具有500 nm级分辨率，可以在同一切片上实现转录组和蛋白组的共检测，可检测蛋白重数为100+。利用强大的多组学分析工具，通过空间条形码(Coordinate lD，CID)还原回空间位置，生成单细胞或亚细胞级基因和蛋白表达图谱。

Q 目前的产品适配哪些抗体panel？可以兼容多少重蛋白检测？是什么类型的抗体？这些蛋白靶点主要是什么研究领域的？展开收起

A

本产品可兼容三类蛋白抗体Panel实现不同重数的蛋白检测。

（1）已预混好的商品化蛋白Panel，例如：针对小鼠样本，可检测119个靶点，推荐抗体为TotalSeq™-A Mouse Universal Cocktail, V1.0 (Biolegend, Cat. No.199901，119重抗体+9重同型对照)；针对人的样本，可检测154个靶点，推荐抗体为TotalSeq™-A Human Universal Cocktail, V1.0(Biolegend, Cat. No.399907，154重抗体+9重同型对照)。这些Panel靶向的蛋白主要为细胞表面蛋白，包括一些免疫细胞分型的蛋白等。

（2）自由混合的TotalSeq ™ -A系列抗体，重数取决于您的选择；（3）自由混合的自偶联抗体，例如：先使用Stereo-seq 自偶联试剂盒将您感兴趣的一抗偶联上ADT寡核苷酸标签，验证好这些抗体可用于Stereo-CITE流程后，即可自由混合成您想要的重数。

Q 时空蛋白转录组匹配的生信分析软件版本号分别是什么？如果目前使用的版本号比推荐版本号低，是否需要更新？展开收起

A

时空蛋白转录组适配的软件版本号分别为：SAW≥v8.1.3，StereoMap≥v4.1.2。如果您的软件当前版本低于推荐版本号，需要先升级到对应版本后，再进行分析。

Q 时空转录组文库和ADT文库是否要分开建库？其测序策略是什么？如果需要加测，应如何测序？展开收起

A

是的，两种文库要分开建库。测序策略如下：

1）使用DNBSEQ-T7RS进行测序，为了保证测序时的碱基平衡，需要将带有不同Sample Barcode的ADT文库与转录组文库共同测序。建议将拟混合测序的ADT和转录组文库先各自制备 DNB后。通过确定的数据量需求和已知的DNB浓度来计算每个样本所需的DNB体积，即按照DNB投入质量比pooling。例如：转录组需2G reads数据量，蛋白组需要1G reads数据量，pooling时质量比为转录组：蛋白组=2:1。测序类型为：50+100+10。当下机数据不足需要加测时，要求用PE75测序试剂，蛋白组和转录组可共同测序，任一蛋白组可和任一转录组混合搭配测序，无需搭配同一样本的蛋白组或转录组。

2）使用MGISEQ-2000RS测序，建议制备完DNB后将转录组文库和ADT文库加载到不同flowcell测序，转录组文库测序类型为：50+100+10，ADT文库测序类型为：50+36+10。当下机数据不足需要加测时，按相同方法加测即可。

Q 在玻片上画疏水圈的注意事项有哪些？展开收起

A

1、组织固定结束0.1X SSC浸泡后，立即用无尘纸擦去玻片背面和组织四周的残液，确保组织周2、围无液体残留，并画上疏水圈。这样操作可使组织内湿润但组织外周干燥，方便画疏水圈。

3、画疏水圈时，将玻片放在免疫组化湿盒内，用手按住玻片后再画疏水圈，避免玻片移动。

4、加液时要加在疏水圈内，液体覆盖住整个组织即可。液体过多则容易溢出疏水圈，存在疏水圈难以封住液面的风险。

5、吸弃液体时，先平着吸走液体，再微微倾斜载玻片吸液。

Q 如果抗体存在研发已测试Biolegend TotalSeqA单抗体列表中，客户是否需要做相关验证实验？展开收起

A

如果存在于该抗体列表中，为了确保TotalSeq ™ -A抗体适用于组织切片并且确认抗体最佳稀释比例，建议先在玻片上利用感兴趣的组织类型进行抗体滴定实验，在验证每个抗体可以工作的最佳浓度后，最后在芯片上开展正式实验。

Q 样本先用PFA固定，再用OCT包埋后，是否可以用于时空蛋白转录组实验？展开收起

A

不可以。时空蛋白转录组实验流程目前只适用于新鲜包埋样本，暂不兼容PFA样本。采用的是贴片后4% PFA试剂在时空蛋白转录组实验中的作用是用于组织切片贴片后的固定步骤。

Q 一个细胞的大小和square bin size的关系是怎样的？展开收起

A

以一个细胞的直径为10 μm左右计算时，一个细胞约相当于bin20（10 μm x 10 μm）或 bin14（取diagonal = 10 μm）。