• 目前IF图像需要与DAPI图一起QC，QC内容包括DAPI图的track线识别、DAPI/IF图显微镜拼接效果评估、以及DAPI和IF图基于组织形态的校准评估。

• DAPI图的track线识别QC为后续与芯片自动配准提供基准线模版；显微镜拼接效果评估用于判断显微镜的拼接大图是否存在明显错位，为后续组织分割和配准提供质量保证；校准评估用于保证IF图可以复用DAPI图的拼接、旋转缩放、平移翻转信息进行相同的操作，与表达矩阵配准。

• 但由于IF图的组织形态不一定是完整全组织形态，所以这种场景下校准模块QC可能会无法通过。这时可以使用ImageStudio的“图像校准”模块进行图像间的两两校准。

•         在DAPI图像的track线识别和显微镜拼接模块失败的情况下，目前无法继续进行IF图像的后续处理流程

• 免疫荧光图存在荧光信号的区域表示该区域存在表达目标蛋白的细胞。强荧光信号表示表达目标蛋白的细胞多且密集。

• SAW流程中的register模块使用图像处理算法，根据IF图的灰度情况自动计算阈值，过滤提取图像前景区域，剔除亮度低的背景区域。再使用根据阈值提取的mask文件接入tissueCut模块便可以得到IF图对应区域的表达矩阵了。

• 如果对根据算法自动计算出的灰度阈值得到的分割结果不满意，可以通过ImageStudio的“组织分割”模块对IF图进行手动阈值调整，手动得到图像分割结果。

• 细胞分割的效果受到显微镜拍照的情况和分割算法等多重因素的影响。拍照时如果存在组织过曝、模糊等因素，会影响算法识别细胞，导致无法分割。对于密集区域本身清晰度不够，并且可能存在细胞重叠的情况，那么也会导致算法难以识别。如果图像中组织不同区域局部亮度不均匀、或者存在实验导致的拖尾、背景存在杂质等情况，也会导致分割错误（部分示例见下方）。

• 从算法本身来讲，因为分析流程的自动分割算法是基于人工标注的数据集，学习训练而来，所以一些非常少见的细胞形态未能涵盖进数据集中，也可能会导致算法无法准确识别出细胞。

• 如果自动算法分割效果不佳，可以尝试使用ImageStudio桌面端图像处理软件进行手动调整，也可以尝试用使用Stereopy或其他算法重新分割。如果希望细胞分割出的细胞面积更大，可以尝试在分割之后使用Stereopy的细胞修正算法对细胞直径进行扩大，以覆盖更大的面积。

A：HTML报告中的饱和度分析可评价测序数据的整体质量，为提高计算效率，在bin200维度下从成功注释reads中进行小样本随机抽样，故同一数据多次运行的结果可能略有区别，拟合公式不完全相同，但曲线整体形态一致。

图1：对抽样样本中的Unique Reads(CID、geneName和MID都唯一的reads)进行统计，饱和度值=1-(Unique Reads)/(Total Annotated Reads)，随着抽样量增加，拟合曲线近平缓代表数据趋于饱和，是否加测需根据项目整体设计和样品情况而定，例如珍贵样品建议可加测，报告中的阈值0.8只作为建议指导的提示。

图2：随机抽样数量增加，bin200维度下的基因中位数逐渐增加。

图3：根据随机抽样样本的Unique Reads数据拟合而出的曲线，拟合曲线R² >=0.9。

（注：三张图片的x轴相同，y轴分为饱和度值、基因中位数和Unique Reads数量）