数据再分析

本教程将将展示如何运行辅助分析流程 saw reanalyze，进行

• cluster 聚类分析
• lasso 区域的表达矩阵提取
• diffExp 差异表达分析
• coExp 空间基因共表达分析
• multiomics 蛋白组&转录组联合分析
• midFilter 基于自定义MID范围过滤矩阵
• removeBackground 自动去除蛋白背景信号

聚类分析

在生信下游分析中，聚类是一种关键且基本的算法处理，可将具有相似特征的空间表达点归为同组，该过程有助于揭示表达数据中的底层结构和模式。

在进行分析前，需要根据数据的物种和组织类型来选择合适的 bin size 例如，哺乳动物细胞的直径约为 10 µm，DNB 的物理间距为 500 nm，因此 bin20 会是一个合适的选择。

调用 Leiden 算法 进行聚类时，--Leiden-resolution 参数的默认值为 1.0，它可以调控 Leiden 聚类时的分群颗粒度，值越大，分群簇越多。并且，可以开启 --marker 参数，基于 Leiden 算法的分群结果进行差异表达分析。

如果使用 bin GEF 进行聚类，运行命令如下：

saw reanalyze cluster \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --bin-size=20 \
    --Leiden-resolution=1.0 \
    --marker \
    --output=/path/to/output/clustering

基于 bin GEF 的聚类输出如下：

clustering
├── <SN>.bin20_1.0.h5ad  ##<SN>.<bin_size>_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── bin20_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

如果使用 cellbin GEF 进行聚类，运行命令如下：

saw reanalyze cluster \
    --cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
    --Leiden-resolution=1.0 \
    --marker \
    --output=/path/to/output/clustering

基于 cellbin GEF 的聚类输出如下：

clustering
├── <SN>.cellbin.gef  ##a copy of input cellbin GEF but with new clustering information
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad  ##<SN>.cellbin_<resolution>.h5ad, containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

图像嵌入

cluster 模块现在支持将显微镜图像嵌入到输出的 AnnData H5AD 文件中。这使得空间表达矩阵能够无缝叠加到组织形态上，从而便于进行直观的下游可视化与验证。

saw reanalyze cluster \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --bin-size=20 \
    ...
    --output=/path/to/output/clustering_with_img \
    --image=/path/to/registered/microscope/image/tiff \
    --layer=<layer_name>
    
#the same to cellbin GEF

嵌入的图像数据存储在 H5AD 文件内部的 /uns/spatial/<layer_name> 组中：

$ h5dump -n ./output_with_image.h5ad
HDF5 "/output_with_image.h5ad" {
FILE_CONTENTS {
 group      /
 group      /X
 ...
 group      /uns/spatial
 group      /uns/spatial/<layer_name>
 group      /uns/spatial/<layer_name>/...
 ...

多样本场景

若要跨多个样本执行聚类和差异表达分析，需要基于 H5MU 文件进行分析。.h5mu 格式封装了整合多样本的数据集，将其作为识别跨样本聚类的标准输入文件。

saw reanalyze cluster \
    --h5mu=/path/to/input/H5MU \
    --Leiden-resolution=1.0 \
    --marker \
    --output=/path/to/output/reclustering

输出的 H5MU 文件的 Bin 大小与输入文件保持一致。基于 H5MU 进行聚类的输出结果目录结构如下所示：

reclustering
├── <file_prefix>.binN_1.0.h5mu
├── <file_prefix>.binN_1.0_marker_features.csv
└── <file_prefix>.binN_1.0_find_marker_genes.csv

矩阵套索

StereoMap 中的交互式工具可以 lasso （手动圈选）感兴趣区域，它需要 saw reanalyze 分析流程来协助将 lasso GeoJSON 中区域信息转化为特征表达矩阵。

如果使用 bin GEF 进行 lasso，运行分析如下：

saw reanalyze lasso \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --lasso-csv=/path/to/lasso/csv \
    --bin-size=1,20,50 \
    --output=/path/to/output/lasso

##  --lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON

基于 bin GEF 的 lasso 输出如下：

lasso
├── <label1>
│       ├── SN.<label1>.label.gef  ##lasso GEF of bin1
│       └── segmentation
│              ├── SN.lasso.<bin_size_list[0]>.<label1>.gem.gz  ##GEM of lasso area of different bin sizes
│              ...
│              ├── SN.lasso.<bin_size_list[n]>.<label1>.gem.gz
│              └── SN.lasso.<label1>.mask.tif  ##mask image of lasso area
└── <label2>
       ├── ...
       └── ...

如果使用 cellbin GEF 进行 lasso，运行分析如下：

saw reanalyze lasso \
    --cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
    --lasso-csv=/path/to/lasso/csv \
    --output=/path/to/output/lasso

##  --lasso-geojson=/path/to/lasso/GeoJSON

基于 cellbin GEF 的 lasso 输出如下：

lasso
├── <label1>
│       ├── SN.<label1>.label.cellbin.gef  ##cellbin GEF of lasso area
│       └── SN.lasso.cellbin.<label1>.mask.tiff  ##cell segmentation of lasso area
└── <label2>
        └── ...

差异表达分析

SAW reanalyze 可以使用来自 StereoMap 的 diffexp GeoJSON 文件，基于聚类类群选择和套索区域进行差异表达分析。

运行分析如下：

saw reanalyze diffExp \
    --count-data=/path/to/previous/SAW/count/result/folder/id \
    --diffexp-csv=/path/to/StereoMap/diffexp/csv \
    --output=/path/to/output/differential_expression

##  --diffexp-geojson=/path/to/StereoMap/diffexp/GeoJSON

差异表达分析输出如下：

differential_expression
├── <SN>.<bin_size>_1.0.h5ad  ##H5ad containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── <bin_size>_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

或：

differential_expression
├── <SN>.cellbin_1.0.h5ad  ##H5ad for cellbin containing analysis results
├── find_marker_genes.csv  ##original output CSV
└── cellbin_marker_features.csv  ##formatted CSV for visualization in StereoMap

多样本场景

若要跨多个样本执行差异表达分析，需要基于 H5MU 文件进行。

saw reanalyze diffExp \
    --h5mu=/path/to/input/H5MU \
    --diffexp-csv=/path/to/diffexp/csv

输出的 H5MU 文件的 bin 大小与输入文件保持一致，基于 H5MU 的分析输出结果目录结构如下所示：

multi_sample_diffexp
├── <file_prefix>.binN_1.0.h5mu
├── <file_prefix>.binN_1.0_marker_features.csv
└── <file_prefix>.binN_1.0_find_marker_genes.csv

空间基因共表达分析

空间基因共表达分析（Spatial gene co-expression analysis）是一种通过整合基因表达数据和空间位置信息来构建基因间关联网络的计算方法。该方法旨在阐明基因间的相互作用模式，识别高度共变的基因集，并揭示基因功能和核心调控基因。

运行共表达分析：

saw reanalyze coExp \
    --gef=/path/to/input/bin/GEF \
    --bin-size=20 \
    --top-gene=5000 \
    --output=./gene_co-expression

基于 bin GEF 的空间基因共表达输出如下：

spatial_gene_co-expression
├── <SN>.<bin_size>.coexp.h5ad  ##h5ad containing analysis results
└── <SN>.<bin_size>.coexp.csv  ##analysis output CSV

当检查输出分析 CSV 文件时，有四列描述[基因-基因]共表达相关的信息：基因 ID、基因名称和每个基因的 Moran 指数等级。

$ head C04496D6_tissue_bin20/C04496D6.bin20.coexp.csv

module,geneid,real_gene_name,highly_variable_rank
Module0,ENSMUSG00000002107,Celf2,17.0
Module0,ENSMUSG00000028399,Ptprd,20.0
Module0,ENSMUSG00000063142,Kcnma1,27.0
Module0,ENSMUSG00000028519,Dab1,31.0
Module0,ENSMUSG00000054728,Phactr1,35.0
Module0,ENSMUSG00000059003,Grin2a,38.0
Module0,ENSMUSG00000049336,Tenm2,45.0
Module0,ENSMUSG00000020704,Asic2,48.0
Module0,ENSMUSG00000028033,Kcnq5,54.0

基于cellbin GEF进行共表达分析：

saw reanalyze coExp \
    --cellbin-gef=/path/to/input/cellbin/GEF \
    --top-gene=5000 \
    --output=./gene_co-expression

基于 cellbin GEF 的空间基因共表达输出如下：

spatial_gene_co-expression
├── <SN>.cellbin.coexp.h5ad  ##h5ad containing analysis results
└── <SN>.cellbin.coexp.csv  ##analysis output CSV

蛋白组&转录组联合分析

saw multiomics 可以整合RNA和蛋白质数据，并通过 TotalVI 变分推断计算潜在空间。对潜在空间进行聚类分析，并进行 one-vs-all 差异表达分析，以找到标记基因和蛋白质。

您可以使用基因和蛋白 bin GEF进行联合分析，运行分析如下：

saw reanalyze multiomics \
    --gef=/path/to/input/gene/GEF,/path/to/input/protein/GEF \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --bin-size=50 \
    --output=/path/to/output/joint_analysis

或使用基因和蛋白 cellbin GEF进行联合分析：

saw reanalyze multiomics \
    --cellbin-gef=/path/to/input/gene/cellbin/GEF,/path/to/input/protein/cellbin/GEF \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --output=/path/to/output/joint_analysis

联合分析输出如下：

joint_analysis
├── <SN>.<bin_size>.differential_expression.csv ##original outoput CSV containing differential expression results
└── <SN>.<bin_size>.h5mu ##mutimodal data containing clustering results

或:

joint_analysis
├── <SN>.cellbin.differential_expression.csv ##original outoput CSV containing differential expression results
└── <SN>.cellbin.h5mu ##mutimodal data containing clustering results

基于自定义MID范围过滤矩阵

StereoMap 中的交互式工具可以手动设置 feature 的 MID 范围。

saw reanalyze midFilter \
    --gef=/path/to/input/GEF \
    --mid-json=/path/to/FilterMID.json \
    --output=/path/to/output/mid_filtering

输出如下：

mid_filtering
└── <SN>.filter.gef ##common GEF filtered by MID range

或：

mid_filtering
└── <SN>.protein.filter.gef ##protein GEF filtered by MID range

自动去除蛋白背景信号

一种自动去除非特异性结合蛋白信号的方法。算法细节请查阅 Proteome background removal 。

saw reanalyze removeBackground \
    --gef=/path/to/output/input/protein/GEF \
    --bin-size=50 \
    --protein-panel=/path/to/ProteinPanel.list \
    --output=/path/to/output/removeBackground

基于蛋白 bin GEF 的输出如下：

removeBackground
└── A03684D4.protein.tissue.rmbg.gem.gz ##protein expression matrix after backgrou